Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

De Wikillerato

PCR son las siglas en inglés de reacción en cadena de la polimerasa Polymerase Chain Reaction. Se trata de una técnica imprescindible en cualquier laboratorio de investigación, y se ha convertidio sin duda en la más famosa gracias a sus aplicaciones en medicina forense. Básicamente se trata de una serie de reacciones que acaban produciendo millones de copias de un fragmento concreto de ADN partiendo de una o unas pocas copias iniciales.

La clonación génica mediante técnicas de ADN recombinante revolucionó la biología a principios de la década de los setenta, al permitir a los investigadores aislar y amplificar genes individuales para el análisis de su secuencia , expresión y regulación. Entre 1983 y 1986, Kary Mullis desarrolló una nueva técnica igualmente revolucionaria, que permite realizar la amplificación in vitro de muestras de DNA extraordinariamente pequeñas, sin necesidad de una transferencia previa a células vivas. Esta técnica, denominada PCR (del inglés reacción en cadena de la polimerasa) ha ampliado enormemente el poder de la investigación del DNA recombinante, incluso ha reemplazado a muchas de las técnicas anteriores. La PCR permite la amplificación directa de fragmentos de DNA específicos sin clonación ,y puede partirse de cantidades de DNA infinitesimalmente pequeñas; evitando el largo y tedioso trabajo de clonación y reclonación que requerían las primeras técnicas. Así , ha facilitado enormemente el análisis de los genes eucariotas, ya que evita parte de los problemas que comporta la clonación de DNA procedente de genomas muy grandes. Así mismo, ha encontrado numerosas aplicaciones en un amplio abanico de disciplinas.

La PCR se basa en la actividad de la enzima DNA polimerasa , que en presencia de cebadores y nucleósido trifosfato es capaz de amplificar el segmento de DNA que hayamos seleccionado. El primer paso consiste en sintetizar dos oligonucleótidos con secuencias complementarias a las que flanquean la secuencia que queremos amplificar. Esto se consigue fácilmente con una máquina sintetizadora de DNA. Estos oligonucleótidos suelen tener unos 20 pb. de longitud y actuarán de cebadores para la polimerasa. El mecanismo en si de la reacción consta de tres ciclos:

El DNA que va a amplificarse se desnaturaliza mediante calentamiento para separar sus cadenas complementarias. Normalmente el DNA diana tiene una longitud de 100 a 5000 pb.
Se añaden los cebadores en exceso a medida que se hace descender la temperatura, de forma que éstos puedan formar puentes de hidrógeno al aparearse con las secuencias complementarias para las que los hemos diseñado. El exceso es necesario para asegurarnos que las cadenas de DNA se asociaran con los cebadores en vez de entre sí.
Finalmente, se añaden a la mezcla los nucleósidos trifosfato y en última posición a la DNA polimerasa. Ésta alargará los cebadores y sintetizará copias de las secuencia que hemos seleccionado. Para optimizar el rendimiento de la técnica, hoy día sólo se usan polimerasas que puedan trabajar a temperaturas muy elevadas, como la Vent polimerasa de Thermococcus litoralis o ,sobre todo , la Taq polimerasa de Thermus aquaticus. Así se evita tener que reponer la enzima a cada ciclo .

En teoría , la cantidad de DNA amplificado sólo está limitado por el numero de veces que repitamos estos tres pasos. Así, el progreso del número de copias discurrirá según 2n-1 ; es decir , el segundo ciclo genera 8 copias, el tercero 16, etc....30 ciclos generarán cerca de mil millones de copias ¡y todo ello con cantidades ínfimas de DNA, enzimas y cebadores!. Actualmente, la PCR es ya un proceso automatizado y se realiza en un aparato denominado termociclador.

Se han desarrollado innumerables aplicaciones de esta técnica en los más diversos campos aparte de la biología molecular y la biotecnología. Por ejemplo, en medicina forense se puede usar para amplificar pequeñas cantidades de material orgánico (pelo, semen, piel...) e inculpar a un sospechoso. Asimismo es útil en los litigios de paternidad. El campo de la antropología molecular se ha desarrollado a partir del surgimiento de esta técnica, y sus resultados en el análisis de el genoma mitocondrial humano ya comienza a arrojar luz sobre “el eslabón perdido”. Similar es también el campo de la arqueología molecular, donde gracias a muestras biológicas preservadas durante mucho tiempo podemos conocer más sobre el pasado de la Tierra. La PCR también se utiliza en microbiología ambiental, y en el diagnóstico de cada vez mayor número de enfermedades, desde el SIDA hasta la Tripanosomiasis africana. Además es muy útil para el diagnóstico de enfermedades genéticas en el embrión, y está siendo de gran ayuda en la investigación contra el cáncer.

Sin embargo , a pesar de su indudable importancia; la PCR tiene también sus limitaciones. Así, por ejemplo, dado que algunas DNA polimerasas termoestable carecen de actividad 3´ exonucleasa correctora de pruebas, la amplificación de un fragmento puede ser relativamente inexacta . Aunque los errores se distribuyen uniformemente por la muestra y para una secuanciación no son significativos, si pueden serlo si nuestro objetivo es clonar el producto de la amplificación. Por otra parte, la más pequeña contaminación del material inicial con otro DNA puede estropear los resultados. Células desprendidas de la piel de uno de los operarios del laboratorio de medicina forense pueden contaminar las muestras biológicas recogidas en el escenario de un crimen, entorpeciendo lo obtención de unos resultados fiables.